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正確使用是確保端粒酶活性檢測試劑盒實驗結果準確性的關鍵
發布時間： 2025-10-20 點擊次數： 159次端粒酶活性是細胞增殖潛能與衰老狀態的重要標志，在癌癥研究、干細胞生物學及抗衰老領域具有關鍵意義。端粒酶活性檢測試劑盒通過擴增端粒酶延伸的產物，實現對酶活性的高靈敏度檢測。為確保端粒酶活性檢測試劑盒實驗結果的準確性與可重復性，掌握科學、規范的使用方法至關重要。
第一步：實驗前準備與環境控制在潔凈、無核酸污染的實驗室進行操作，避免外源DNA或RNase污染。使用專用移液器、槍頭與離心管，建議使用帶濾芯的吸頭。提前將試劑盒各組分從-20℃冰箱取出，冰上融化后輕柔混勻，避免劇烈震蕩。所有試劑使用后立即放回低溫保存。第二步：樣本制備與處理收集待測細胞（如腫瘤細胞、干細胞），用預冷PBS洗滌2-3次。采用裂解緩沖液（通常含CHAPS、DTT等）冰上裂解細胞15-30分鐘，期間輕搖數次。4℃下12,000×g離心20分鐘，取上清即為端粒酶提取物。蛋白濃度建議調整至0.1-2μg/μL，分裝后-80℃保存，避免反復凍融。第三步：反應體系配制按說明書比例配制PCR反應混合液，通常包括：端粒酶引物（TS引物）擴增引物（CX引物）dNTPsTaq DNA聚合酶緩沖液在冰上操作，逐項加入，輕柔混勻，短暫離心去除氣泡。建議設置三類對照：陽性對照：試劑盒提供的端粒酶陽性提取物陰性對照：熱滅活樣本（85℃加熱10分鐘）空白對照：以裂解液代替樣本第四步：端粒酶延伸與PCR擴增取適量樣本提取物加入反應體系，先進行延伸反應（30℃孵育30分鐘），使端粒酶在TS引物上添加TTAGGG重復序列。隨后進行PCR擴增（94℃變性2分鐘；94℃ 30秒，50-60℃退火30秒，72℃延伸30秒，循環25-35次；72℃終延伸5分鐘）。第五步：產物檢測與分析擴增完成后，取10-15μL產物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）或瓊脂糖凝膠電泳。銀染或EB染色后觀察梯狀條帶——每相差6bp形成一條帶，表明端粒酶活性存在。也可使用熒光定量法（qTRAP）進行定量分析，繪制標準曲線計算相對活性。第六步：數據記錄與結果判讀記錄樣本來源、蛋白濃度、循環數及電泳結果。陽性對照應呈現清晰梯形條帶，陰性對照無條帶或極弱，空白對照無信號。樣本條帶強度可半定量反映端粒酶活性水平。- 下一篇：沒有了
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