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主營(yíng)產(chǎn)品:主要技術(shù)服務(wù):細(xì)胞STR鑒定;支原體檢測(cè);細(xì)胞種屬檢測(cè);端粒長(zhǎng)度檢測(cè);端粒酶活性檢測(cè)等。

產(chǎn)品展示PRODUCTS

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端粒酶活性檢測(cè)試劑盒

端粒酶活性檢測(cè)試劑盒

更新時(shí)間:2025-05-06

訪問(wèn)量:2207

廠商性質(zhì):生產(chǎn)廠家

生產(chǎn)地址:上海

簡(jiǎn)要描述:
端粒酶活性檢測(cè)試劑盒本產(chǎn)品試劑KIT采用雙色熒光qPCR(TaqMan探針?lè)ǎz測(cè)端粒酶催化亞基TERT基因。通過(guò)提取細(xì)胞RNA,利用特異性逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),以cDNA為模板在單管中利用多重?zé)晒舛縋CR進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)(雙重探針:FAM、Cy5)。選用293T細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照以及MRC-5細(xì)胞為陰性對(duì)照,通過(guò)??CT法檢測(cè)樣本中TERT基因的相對(duì)表達(dá)量。
品牌其他品牌供貨周期兩周
應(yīng)用領(lǐng)域醫(yī)療衛(wèi)生,生物產(chǎn)業(yè),制藥/生物制藥

【產(chǎn)品規(guī)格】

BPT50  50T(50人份,分五個(gè)**包裝)

【產(chǎn)品說(shuō)明】

端粒酶活性檢測(cè)試劑盒(Telomerase)是一種酶促核糖**白復(fù)合物。其催化亞基(TERT)具有逆轉(zhuǎn)錄酶的特性,TERT被認(rèn)為是端粒酶活性表達(dá)的關(guān)鍵組分,其編碼的mRNA水平與端粒酶活性一致,與端粒酶的活化程度密切相關(guān)。因此,對(duì)端粒酶催化亞基的檢測(cè)可以間接反映樣本中端粒酶活性。

本產(chǎn)品試劑KIT采用雙色熒光qPCR(TaqMan探針?lè)ǎz測(cè)端粒酶催化亞基TERT基因和內(nèi)參基因***DH。通過(guò)提取細(xì)胞RNA,利用特異性逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),以cDNA為模板在單管中利用多重?zé)晒舛縋CR進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)(雙重探針:FAM、Cy5)。選用293T細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照以及MRC-5細(xì)胞為陰性對(duì)照,通過(guò)??CT法檢測(cè)樣本中TERT基因的相對(duì)表達(dá)量。該試劑KIT具有以下特點(diǎn):

1. 靈敏:雙色探針,靈敏度高。

2. 穩(wěn)定:全程閉管操作,無(wú)交叉污染。

3. 可靠:含內(nèi)參基因,避免假陰性。

4. 方便:操作簡(jiǎn)單,無(wú)需電泳步驟。

5. 定量:以CT值判斷,可定量檢測(cè)。


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端粒酶活性檢測(cè)試劑盒運(yùn)輸及保存條件】

低溫冷凍運(yùn)輸,避光-20℃保存,保質(zhì)期6個(gè)月。開(kāi)蓋后,4℃保存,保質(zhì)期1周。

【產(chǎn)品組分】

注:1.本試劑盒提供試劑,使用前先低速離心、后小心開(kāi)啟。使用時(shí)請(qǐng)上下輕柔顛倒十次混勻,避免起         泡,并低速短暫離心后使用;

2.為了避免反復(fù)凍融,10 人份/管作為一個(gè)包裝。

【操作步驟】

1. 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

使用Trizol法抽提細(xì)胞RNA,RNA純度A260/280在1.9-2.0之間。取1ug RNA使用Thermo逆轉(zhuǎn)錄試劑KIT(貨號(hào):K1622),將試劑KIT中的Random Primer替換成Biowing®Specific Reverse Transcription  Primers進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。

1.1 DNase I處理

     

                 反應(yīng)程序:37℃ 30min;加EDTA 1 µL 后,65℃,10min


1.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)      

反應(yīng)程序:20℃ 10min;42℃ 1h;72℃ 5min

2. qPCR反應(yīng)體系及條件

2.1 陽(yáng)性對(duì)照處理

將陽(yáng)性對(duì)照cDNA進(jìn)行2倍、4倍的梯度稀釋?zhuān)總€(gè)梯度建議三重復(fù)。

2.2 陰性對(duì)照處理

將陰性對(duì)照cDNA進(jìn)行2倍、4倍的梯度稀釋?zhuān)總€(gè)梯度建議三重復(fù)。

2.3 樣本處理

將待測(cè)樣本cDNA進(jìn)行2倍稀釋作為測(cè)試濃度,每個(gè)樣本做三重復(fù)。

  反應(yīng)體系(以20µL為例)      


PCR儀設(shè)置(以ABI 7500為例)      


【基線(xiàn)設(shè)置】(以ABI 7500為例)

一般默認(rèn)起始和終止基線(xiàn)位置為3-15個(gè)循環(huán),應(yīng)根據(jù)內(nèi)參基因和TERT基因?qū)嶋H擴(kuò)增曲線(xiàn)手動(dòng)將基線(xiàn)起始循環(huán)數(shù)調(diào)整為指數(shù)增長(zhǎng)期之前即可。

【閾值設(shè)置】(以ABI 7500為例)

內(nèi)參閾值設(shè)定:以陽(yáng)性對(duì)照2倍稀釋cDNA定內(nèi)參基因擴(kuò)增曲線(xiàn)閾值,內(nèi)參基因(Cy5)初始濃度的CT值定為16±3;

TERT閾值設(shè)定:以陽(yáng)性對(duì)照2倍稀釋cDNA定TERT基因擴(kuò)增曲線(xiàn)閾值,TERT基因(FAM)初始濃度CT值的定為25±3。

【結(jié)果判讀】

               

圖1 左:陽(yáng)性293T細(xì)胞的擴(kuò)增曲線(xiàn);右:陰性MRC-5細(xì)胞的擴(kuò)增曲線(xiàn)

     (藍(lán)色為T(mén)ERT基因曲線(xiàn),黃綠色為內(nèi)參基因曲線(xiàn))

1. 陽(yáng)性對(duì)照2倍稀釋后TERT基因Ct值在 25±3,內(nèi)參基因Ct值在16±3,4倍稀釋后TERT基因Ct值               在26±3,內(nèi)參基因Ct值在17±3。

TERT基因和內(nèi)參基因之間?CT維持在9±3,保持穩(wěn)定。

2. 陰性對(duì)照經(jīng)2倍、4倍梯度稀釋后,TERT基因Ct值≥35(或檢測(cè)不到),內(nèi)參基因Ct值仍在13-20之間,判定為端粒酶活性為陰性。

3. 結(jié)果說(shuō)明

若待測(cè)樣本內(nèi)參基因Ct值在13-19之間,TERT基因Ct值<35且擴(kuò)增曲線(xiàn)正常,則樣本端粒酶活性為陽(yáng)性。

若待測(cè)樣本內(nèi)參基因Ct值在13-19之間,TERT基因Ct值≥35且無(wú)明顯的擴(kuò)增曲線(xiàn)則樣本無(wú)端粒酶活性。

【說(shuō)明】

1. 待測(cè)樣本cDNA 2倍稀釋作為模板,三次技術(shù)重復(fù),不設(shè)置梯度稀釋?zhuān)魂?yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照進(jìn)行2倍、4倍梯度稀釋?zhuān)ㄗh分別做三重復(fù);避免偶然誤差的產(chǎn)生。

2. 如果陽(yáng)性/陰性對(duì)照2倍稀釋后內(nèi)參基因Ct值>19,表明參考品有降解或者試劑盒擴(kuò)增效率下降。

3. 如果所有樣本2倍稀釋后內(nèi)參基因Ct值>19,表明試劑盒的擴(kuò)增效率下降。

4. 如果陽(yáng)性對(duì)照2倍稀釋后TERT基因Ct值>28,表明TERT基因檢測(cè)系統(tǒng)失效。



 

 

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