上世紀50年代研究人員在細胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)了支原體污染，事實上細胞培養(yǎng)過程中支原體污染無處不在。綜合相關數(shù)據(jù)，細胞系支原體污染的平均比例為30-60%之間。細胞培養(yǎng)期間，建議定期進行支原體檢測以防止污染。因此，迫切需要一種快速、全面的檢測方法以應對支原體日常的檢測需求。

支原體的檢測有多種方法，傳統(tǒng)檢測方法和核酸檢測方法。

藥典中對支原體檢測的規(guī)定和要求

《中國藥典》<3301 支原體檢查法>采用了培養(yǎng)法和指示細胞培養(yǎng)法(DNA染色法)，中國藥典指出也可采用經(jīng)國家藥品檢定機構(gòu)認可的其他方法。

檢查支原體采用支原體液體培養(yǎng)基和支原體半流體培養(yǎng)基(或支原體瓊脂培養(yǎng)基)。培養(yǎng)法是用液體或者半流體培養(yǎng)基培養(yǎng)7天后次代培養(yǎng)轉(zhuǎn)種培養(yǎng)21天，一共28天，觀察支原體是否生長。

指示細胞培養(yǎng)法(DNA染色法)是將供試品接種于指示細胞中培養(yǎng)后，用特異熒光染料染色。如樣本有支原體污染，在熒光顯微鏡下可見附在細胞表面的支原體DNA著色。

《歐洲藥典》中<2.6.7>中指出，可通過使用特異性引物擴增測試樣本中提取的核酸來檢測支原體，但需要進行方法學驗證。在適當?shù)尿炞C之后，核酸擴增技術(shù)NAT可以代替培養(yǎng)法和指示細胞培養(yǎng)法。

支原體的核酸檢測方法

培養(yǎng)法和指示細胞培養(yǎng)法(DNA染色法)能很好地檢測生物制品或細胞中的支原體活菌，但耗時長。翼和生物自主研發(fā)的3款支原體檢測試劑盒，均采用熒光定量qPCR方法定性檢測細胞或者生物制品中是否存在支原體污染，并且進行了方法學驗證。

翼和生物支原體檢測試劑盒，采用雙色熒光qPCR(TaqMan探針法)檢測支原體DNA，檢測對象為細胞培養(yǎng)的上清液或細胞本身、血液、其他生物制品等。操作簡便、快捷、方法特性符合要求。

細胞支原體檢測試劑盒方法學驗證

翼和生物依據(jù)歐洲藥典推薦的核酸檢測支原體檢查法驗證方案，對試劑盒的專屬性、線性范圍及檢測限、耐用性進行了驗證。結(jié)果表明，翼和生物細胞支原體檢測試劑盒這三方面特性均符合要求，配合核酸提取，檢測靈敏度可達到10 CFU/mL，可替代培養(yǎng)法，用于細胞存儲庫、細胞治療用途的細胞和生物制品中的支原體污染檢測，不同型號的試劑盒可用于日常檢測或者放行檢測。試劑盒使用時進行適用性確認即可。

適應樣本類型和處理方案：

細胞培養(yǎng)上清、細胞懸液、血液，可用快檢直擴方案

低溫保存的血清、臍帶血、胰酶、抗生素、未使用的 培養(yǎng)液等生物制品，即使存在支原體污染，一般支原體含量也較少，建議提取樣本DNA后檢測，可用快檢試劑盒。