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支原體QPCR檢測,三復孔重復性不好的原因?
發布時間: 2025-05-22 點擊次數: 43次復孔重復性不好,可能有以下幾種原因:
首先,判斷各個參數設置是否正確,例如是否扣除ROX(ABI系列機器)、基線和閾值線等;
其次,判斷內參通道是否異常,判斷PCR反應是否正常進行;
第三,CT值是否落在35之后,這是熒光定量PCR反應的灰區,在這個區間的CT值重復性非常差;
第四,試劑盒本身問題,酶、引物探針、反應條件等優化不完善;
第五,加樣誤差;
第六,儀器長時間未校準。
針對這幾種原因,進行逐一排查
第一種情況,排查各類參數設置,看看是否能夠解決問題;
第二種情況,如確實內參通道CT值異常,明顯偏離說明書設定的范圍,則樣本中存在PCR抑制成分,需稀釋10倍或抽提核酸進行檢測;
第三種情況,需依據擴增曲線是否具備典型的S型來判斷,如兩次檢測均具備典型的S型擴增曲線,則判為支原體陽性,樣本發生了極其微弱的支原體污染;反之,則應為支原體陰性。
第四種情況,需要重新優化試劑盒。
第五種情況,建議移液器定期校準,使用時規范操作。
第六種情況,儀器要定期校準。
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