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    對列樣本目標區(qū)域甲基化---WGBS后的正確打開方式

    發(fā)布時間: 2024-05-27  點擊次數(shù): 540次

    表觀遺傳學(epigenetics)是目前分子生物學研究的熱點之一,DNA甲基化是表觀遺傳學的重要內(nèi)容,是基因組DNA的主要表觀遺傳修飾形式之一。DNA甲基化修飾對于維持正常細胞功能、傳遞基因組遺傳印記、胚胎發(fā)育、衰老以及人類tumour發(fā)生,起著至關(guān)重要的作用。

    全基因組甲基化研究方法主要有全基因組甲基化芯片、全基因組甲基化重測序(WGBS)和簡化亞硫酸氫鹽測序技術(shù)(RRBS),這些方法其實都有個共同的特點:信息量大,得到差異甲基化區(qū)域(DMR)非常多,但是價格昂貴,對個別區(qū)域覆蓋度和測序深度不足,可能會導致遺漏或假陽性結(jié)果。因此,對這些方法篩選出來DMR,需要做進一步的驗證,在隊列樣本中對目標區(qū)域進行甲基化檢測,并分析目標區(qū)域與疾病/性狀的關(guān)聯(lián),才能進一步為疾病與該DMR的關(guān)聯(lián)提供流行病學的證據(jù)。

    Hi-MethylSeq簡介

    目標區(qū)域甲基化重測序(Hi-MethylSeq),又叫重亞硫酸鹽擴增子測序(Bisulfite Amplicon Sequencing,BSAS)。在前期全基因組甲基化測序、全基因組甲基化芯片等工作基礎(chǔ)上,或者依據(jù)文獻報道目的基因甲基化與性狀/疾病關(guān)聯(lián),選擇感興趣的目的區(qū)間或候選基因,利用Hi-MethylSeq技術(shù)對大規(guī)模群體的候選基因甲基化水平進行檢測。

    Hi-MethylSeq技術(shù)通過亞硫酸氫鹽(bisulfite)處理,用多重PCR擴增目的片段,添加barcode和測序通用接頭,在Illumina X10二代測序平臺對PCR產(chǎn)物進行高通量測序,利用生物信息學方法,精確定量計算目標區(qū)間內(nèi)的甲基化位點的甲基化狀態(tài),在完成目標區(qū)域檢測的同時大幅降低研究費用。



    優(yōu)勢及應(yīng)用方向

    1、優(yōu)勢

    Hi-Methylseq結(jié)合了亞硫酸鹽轉(zhuǎn)換、靶向擴增子高通量測序技術(shù),可實現(xiàn)多區(qū)段、多位點的甲基化精確定量分析,特別適合隊列樣本目標區(qū)域的甲基化分析,測序深度高,結(jié)果更加準確。

    2、應(yīng)用

    (1)適用于感興趣的目的片段甲基化研究 ;

    (2)適用于在大樣本中進一步確認全基因組甲基化研究挑選的陽性位點(DMR)。

    3、方向

    農(nóng)口:表觀遺傳學研究、品種鑒定、品種改良

    醫(yī)口:tumour早期診斷、表觀遺傳學生物標志物開發(fā)、tumour復(fù)發(fā)的**預(yù)測因子

    Hi-MethylSeq關(guān)鍵結(jié)果



    結(jié)果對比



    與標準方法結(jié)果一致,但更有優(yōu)勢

    Hi-MethylSeq與BSP結(jié)果一致,而Hi-MethylSeq在研究DNA甲基化時,每一個read 都相當于克隆測序時的一個單克隆,每個區(qū)段得到成千上百個reads,所以用二代測序比亞硫酸氫鹽修飾后的克隆測序技術(shù)得到的結(jié)果更加精確。

    應(yīng)用案例1




    復(fù)發(fā)性妊娠丟失(RPL)是指妊娠24周前連續(xù)兩次或兩次以上的自然流產(chǎn)懷孕,占育齡夫婦的1%。表觀遺傳因素,包括某些基因表達DNA甲基化調(diào)控紊亂可能在RPL中起作用。科研人員利用全基因組甲基化重測序和轉(zhuǎn)錄組測序聯(lián)合分析,鑒定蛻膜和血液中DNA甲基化調(diào)控的RPL相關(guān)基因,并使用翼和生物Hi-MethylSeq進行case和control組的關(guān)鍵基因DMR甲基化檢測。終發(fā)現(xiàn),SGK1和CREB5的異常甲基化可能是神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)的原因之一,這些基因位于子宮內(nèi)膜,可能是導致生殖失敗的原因之一。SGK3在生殖系統(tǒng)中的作用值得進一步調(diào)查。

    應(yīng)用案例2



    研究人員使用全基因組甲基化芯片聯(lián)合生物信息學方法來鑒定自身性免疫性疾病GD的差異甲基化區(qū)(DMR),通過構(gòu)建DMR注釋基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)篩選出關(guān)鍵節(jié)點基因(Hub Gene)。利用翼和生物Hi-MetylSeq技術(shù)分析了關(guān)鍵節(jié)點基因的DMR區(qū)域,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CDKN2C、SERPINA1、IRS4,尤其是B3GNT2是潛在的與GD相關(guān)的異常甲基化基因。這些發(fā)現(xiàn)可能是GD疾病中的DNA甲基化的近報道。

    綜上所述,全基因組甲基化測序分析獲得DMR后,需要在隊列樣本中進行驗證,翼和Hi-MethylSeq技術(shù)是WGBS后續(xù)驗證的有力工具。


    主要參考文獻:Cai et al. Identifying and validating differentially methylated regions in newly diagnosed patients with Graves' Disease. DNA and Cell Biology 2021, 40(3):1-9.

    Zhou et al. Genome wide methylation analysis to uncover genes related to recurrent pregnancy loss. Genes & Genomics 2021, 43(4):361-369.


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